樹突狀細胞（Dendritic cells, DCs）在天然識別病原體和隨后的適應性免疫反應的活化中發(fā)揮著關鍵作用。DCs通過主要組織相容性復合體（MHC）分子呈遞抗原肽來誘導T細胞活化和分化，從而啟動適應性反應。DC還可分泌細胞因子和生長因子，增強并調節(jié)免疫反應。除了活化Naive T細胞的作用外，DCs被認為在引導效應性T細胞的分化以及T細胞耐受性的發(fā)展中起著關鍵作用。雖然DCs存在于體內多種組織中，但含量很少，無法滿足科學研究和臨床治療的需要， 所以學者們嘗試多種方法來體外培養(yǎng)和擴增DC。對于人DCs的獲得，常用的方法是從人外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMCs）誘導產生。而對于小鼠，最常見的方法是從骨髓細胞誘導產生, 即骨髓來源的DC（Bone Marrow-Derived Dendritic Cells, BMDCs）。

鑒于功能分析和分子生物學研究的需要，獲得更高數量和更高純度的BMDCs是大家一直追求的目標。碧芯生物特邀海南醫(yī)學院的張老師與大家分享BMDCs的經典制備方法(Lu, Zhang et al. 2021)，大家可根據自身需要選擇使用，因為試劑的品牌，貨號可能對BMDCs的制備質量具有很大的影響，因此，我們列出了所用的所有試劑的品牌及貨號,以供參考。

1.     試劑的準備

1)   BMDCs培養(yǎng)基：取10 mL胎牛血清（Gibco，貨號：1932597），加入90 mL        RMPI 1640培養(yǎng)基（博士德，貨號：PYG0066），加入β-巰基乙醇               （Amresco，貨號：0482）使得終濃度為50 µM ，具體為取10 µL β-巰基乙醇        加入到1 mL PBS（博士德，貨號：PYG0021），混勻后再從中取出34 µL，         加入至上述的100 mL培養(yǎng)基中即可。

2)  GM-CSF： GM-CSF是成功獲得BMDCs的關鍵試劑，我們實驗室選用的abcam的小鼠重組GM-CSF（abcam貨號：ab9742），預先配制成2 µg/mL的溶液并分裝保存在-80 ^oC：取20 µg GM-CSF，先用 10 mL 含10% FBS（Gibco，Lot：193259）的RMPI 1640培養(yǎng)基（博士德，貨號：PYG0066）溶解，用無菌無內毒素的1.5離心管分裝成每管100 µL，放置于-80 ^oC。

2.     獲得BMDCs

1)    取C57bl/6j小鼠一只，頸椎脫臼法處死，并在消毒酒精中浸泡2分鐘，在超凈工作臺中手術取出所有股骨和脛骨并剪刀和鑷子將骨周圍的肌肉組織盡量去除干凈，浸泡在2 mL PBS中（PBS置于6孔細胞培養(yǎng)板（Corning，貨號：13418002 ）中的一孔）；將骨移入6孔板中的另一個盛有2 mL PBS的新孔中，用剪刀剪去骨兩端，再用注射器抽取PBS，針頭分別從骨兩端插入骨髓腔，反復沖洗出骨髓至培養(yǎng)皿中，直至骨*變白；收集骨髓懸液，并用45微米細胞過濾網過濾（Jet Biofil，貨號：CSS010040），收集細胞懸液，1000 g離心3分鐘，棄上清，往沉淀中加入1 mL紅細胞裂解液（Biosharp，貨號：69015473），輕輕吹打使細胞分散，1分鐘后1000 g離心3分鐘，棄上清，沉淀用PBS（博士德，貨號：PYG0021）洗滌一次，最終用2 mL BMDCs培養(yǎng)基分散，并將細胞分散液轉移至直徑為90 mm細菌培養(yǎng)皿（Nest，貨號：752001）中，再補入6 mL BMDCs培養(yǎng)基，加入80 µL預先配好的GM-CSF溶液(2 µg/mL)使終濃度至20 ng/mL，于二氧化碳培養(yǎng)箱（37 oC， 5% CO2）中培養(yǎng)48小時。

2)   48 h后，再加入8 mL BMDCs培養(yǎng)基以及 80 µL GM-CSF （2 µg/mL）,繼續(xù)培養(yǎng)72小時；

3)   72 h后，換液，并加入80 µL GM-CSF (2 µg/mL)。 注意上清中的細胞不要丟棄。我們的做法如下：將上清轉移至15 mL無菌離心管中（Corning，貨號：15620023）,1000 g離心3分鐘，棄上清，細胞用8 mL BMDCs分散再加回至原細胞培養(yǎng)皿中，再加入GM-CSF 80 µL，在二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

4)    24 h后，取出細胞培養(yǎng)皿，小心晃動細胞培養(yǎng)皿使懸浮細胞分散均勻，取出含有懸浮細胞的培養(yǎng)液離心（注意不要收集貼壁細胞），棄去上清，細胞用含有10%FBS的1640培養(yǎng)基（博士德，貨號：PYG0066）分散并測定細胞濃度，并接種在細胞培養(yǎng)板上，細胞培養(yǎng)板的尺寸根據個人實驗確定。此時獲得的BMDC細胞為未成熟的DC細胞。

5)       加入LPS（Sigma， SMB00610）刺激24 h，我們就可以獲得成熟的BMDCs細胞。

圖1 BMDCs制備方法示意圖

3鑒定BMDCs

如何鑒定獲取了的BMDCs細胞并誘導了DC細胞的成熟呢？本實驗室一般通過用熒光標記的CD11c以及CD80、CD86染色，再用流式細胞技術，通過CD11c陽性細胞的比例明確BMDCs的純度，通過CD80、CD86雙陽的比例明確成熟BMDCs的比例。

此外，我們還通過對比無藥物刺激與LPS刺激BMDCs 24 h后，二者的細胞培養(yǎng)上清中IL-6, TNF-ɑ，MCP-1等細胞因子表達水平的變化來確定BMDCs是否成功獲取以及成熟狀態(tài)。對于細胞因子檢測方面，要同時檢測細胞上清中多個細胞因子的含量，采用ELISA工作量較大，且細胞上清有時可能不夠，因此使用碧芯生物科技有限公司的Beadstar-mPlex^TM小鼠多細胞因子檢測試劑盒（貨號：BS-MC01）可以滿足一次檢測多個細胞因子的需要。通過流式細胞技術，只需要25 µL樣本，就可以同時檢測IL-6, TNF-ɑ，MCP-1等多個細胞因子的濃度。附圖為無藥物刺激與LPS刺激DC細胞24 h后，細胞上清液中IL-6, TNF-ɑ，MCP-1的濃度（采用Beadstar-mPlex^TM多細胞因子檢測試劑盒測得）。

圖2. 無藥物刺激與LPS刺激BMDCs細胞24 h后，細胞上清液中IL-6, TNF-ɑ，MCP-1的濃度

參考文獻：

Lu, Z., Y. Zhang, et al. (2021). "A biotin-avidin-system-based virus-mimicking nanovaccine for tumor immunotherapy." Journal of Controlled Release 332: 245-259.